mezzo HAT

Il terreno HAT (ipoxantina--timidina) è una selezione di mezzi di coltura per linee cellulari di mammifero, che si affidano alla combinazione di amminopterina (un composto che agisce come potente inibitore del metabolismo del folato inibendo l'attività della diidrofolato reduttasi) con l'ipoxantina (un derivato della purina) e la timidina (un deossinucleoside), i quali sono intermediari nella .Il trucco è nel fatto che l'amminopterina blocca la sintesi de novo del DNA, assolutamente necessaria per la divisione cellulare, ma l'ipoxantina e la timidina forniscono alla cellula il materiale necessario per aggirare il blocco (la "via di recupero"), a patto che vi siano i giusti enzimi, cioè copie funzionali dei geni che codificano per essi. L'enzima diidrofolato reduttasi, che produce tetraidrofolato (THF) tramite la riduzione del diidrofolato, è specificatamente bloccato dall'amminopterina. Il THF, agendo in associazione con proteine specifiche, può ricevere delle singole unità di carbonio poi trasferite verso bersagli specifici. Uno dei più importanti bersagli per la riproduzione cellulare è la timidilato sintasi, che crea (TMP) dalla (dUMP). Tramite reazioni addizionali di fosforilazione, la TMP può essere usata per realizzare (TTP), uno dei tre precursori nucleotidici usati dalla DNA polimerasi. Senza il THF richiesto per convertire la dUMP, non ci può essere TTP, pertanto la sintesi del DNA non può procedere finché non viene prodotta TMP da un'altra sorgente. La fonte alternativa è la timidina presente nel mezzo di coltura che può essere assorbita dalle cellule e fosforilate dalla timidina chinasi (TK) in TMP. La sintesi di IMP (precursore da GMP a GTP e da AMP ad ATP) richiede anch'essa THF e può essere aggirata. In questo caso, l'ipoxantina-guanina fosforibosil transferasi (HGPRT) reagisce con l'ipoxantina assorbita dal terreno con , liberando pirofosfato, per produrre IMP tramite una via di riciclo. Pertanto, l'uso del mezzo HAT per le colture cellulari è una forma di selezione artificiale per le cellule che contengono TK e HGPRT funzionanti. Molti utili perfezionamenti dello schema sono resi possibili da veleni che uccidono le cellule, ma ai quali sono immuni in mancanza di uno di questi geni. Così, una cellula carente di TK è resistente alla (BrdU) mentre una carente di HGPRT è resistente alla (6-TG) e alla . La selezione tramite uno degli ultimi due composti, seguita dal terreno HAT, condurrà a .